L4-6809 – Viroidi: odziv in odpornost rastlin

Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije: https://www.ihps.si

Biotehniška fakulteta Univerze v Ljubljani: http://www.bf.uni-lj.si

Hmeljarska zadruga z.o.o. Žalec

Hmeljarstvo Čas: http://www.hmeljarstvo-cas.eu/

Podatki o projektni skupini: (http://www.sicris.si/public/jqm/prj.aspx?lang=slv&opdescr=search&opt=2&subopt=400&code1=cmn&code2=auto&psize=1&hits=1&page=1&count=&search_term=radisek&id=9342&slng=&order_by=)

IZHODIŠČE IN CILJI PROJEKTA

Hkratna prisotnost različnih viroidov v obolelih rastlinah kaže na kompleksno naravo hude viroidne zakrnelosti hmelja, zato smo v okviru projektnega dela opravili etiološke raziskave z namenom razjasnitve vloge posameznih viroidov pri nastajanju bolezenskih znamenj. Ker so viroidna obolenja neozdravljiva je bil pomemben cilj projekta namenjen iskanju odpornih/tolerantnih sort in s tem tudi virov odpornosti, ki bi jih vključili v žlahtnjenje novih sort. Ob omenjenih raziskavah smo razvijali nove diagnostične metode ter tehnike umetnega okuževanja.  Projekt je potekal v obdobju 0.7.2014 – 0.6.2017 (Časovni načrt, pdf [135 kB]) in imel tri raziskovalne cilje, katerih rezultate in zaključke predstavljamo v nadaljevanju.

1 CILJ:  ETIOLOGIJA VIROIDNE ZAKRNELOSTI HMELJA

Z namenom razjasnitve kompleksnosti in razvoja obolenja viroidne zakrnelosti hmelja smo izvedli poskus v katerem smo opravili umetne okužbe  brezviroidnih rastlin hmelja sorte Celeia z vsemi tremi hmeljnimi viroidi  (HLVd, HSVd in CBCVd) v enojni, dvojni in trojni kombinaciji. Rastline smo inokulirali z RNA transkripti posameznih viroidov (Gucek s sod., 2017; Matoušek s sod., 2017). Dodatno obravnavanje so predstavljale kontrolne rastline in rastline okužene z celokupno RNA, pridobljeno iz rastlin okuženimi z viroidno zakrnelostjo hmelja. Na okuženih rastlinah smo v času 2 vegetacij izvajali fenotipske ocene od meritev rasti do ocen izražanja bolezenskih znamenj. Poleg fizioloških meritev smo odziv rastlin na viroide ocenjevali tudi na nivoju kemične sestave in transkriptoma z RNA-seq metodologijo.

REZULTATI FENOTIPSKIH OCEN

Rezultati vizualnih ocenjevanj in meritev so pokazali sinergističen odziv kombinacije viroidov HLVd + CBCVd, saj so okužene rastline razvile zelo izrazita bolezenska znamenja. V primeru samostojnih okužb viroidov smo blažje simptome zaznali le pri CBCVd in HSVd, medtem ko HLVd okužene rastline tudi po 2 letih niso izrazile bolezenskih znamenj. Kombinacija CBCVd + HSVd je izrazila blažja znamenja, medtem ko so rastline pri kombinaciji vseh treh viroidov HLVd + CBCVd + HSVd izrazile agresivno obolenje. Pri tem je potrebno izpostaviti nižjo stopnjo kompatibilnosti med CBCVd in HSVd, saj smo pri tej kombinaciji imeli najnižjo stopnjo uspešnih okužb in šibke RT-PCR signale viroida HSVd. Rezultati so tako potrdili, da je v primeru nastanka hude viroidne zakrnelosti ključna kombinacija viroidov HLVd+CBCVd. Viroid CBCVd v primeru samostojnih okužb izraža nižjo stopnjo agresivnosti, ki je primerljiva s HSVd (Radisek s sod., 2017; Matoušek s sod., 2017)

REZULTATI KEMIČNIH ANALIZ

Ker inokulirane rastline v zaprtih pogojih mrežnikov niso razvile storžkov smo kemične analize hmelja izvedli na vzorcih listov. UV-VIS analize skupnih polifenolov niso pokazale statistično značilnih razlik med obravnavanji, nadaljnja HPLC analiza alfa in beta-kislin ter ksantohumola, pa je pokazala statistično nižje vsebnosti pri rastlinah okuženimi z nativno RNA in kombinacijo viroidov HLVd+CBCVd (Radisek s sod., 2017). Ker so v listih hmelja zelo nizke koncentracije eteričnih olj smo namesto plinske kromatografije (GC) opravili na vzorcih analizo vsebnosti nekaterih makro in mikroelementov z metodo AAS in UV-VIS. Analize so razkrile do sedaj še neopisan pojav povečanja vsebnosti Fe, predvsem pri rastlinah z izrazitimi simptomi kombinacije viroidov HLVd + CBCVd (Radisek 2017).

REZULTATI ANALIZE TRANSKRIPTOMA

NGS sekvenciranje smo izvedli v treh bioloških ponovitvah s sistemom Ion Proton. Za vsak vzorec smo si zadali cilj, da posekvenciramo do 20 milijonov zaporedij, kar omogoča dovolj natančno analizo diferencialnega izražanja. Cilj smo celo presegli, saj smo povprečno na točko obravnavanja posekvencirali 71.7 milijonov zaporedij, kar skupaj znese 430,2 milijona vseh zaporedij transkriptov hmelja. Skupna količina nukleotidov, ki smo jo določili je znašala 45,9 milijarde bp, kar predstavlja 15 genomskih ekvivalentov hmelja. Podatki take globine so nam omogočili uspešno nadaljnjo bioinformatsko analizo. Odčitke smo mapirali na osnutek genoma hmelja, v povprečju se nam je mapiralo iz podatkovnih setov nad 80 % vseh zaporedij, kar je primerna količina za nadaljnjo obdelavo. RNA-seq diferencialno analizo smo izvedli z EDGE inovativnim algoritmom. Za diferencialno izražene gene smo postavili pogoj p-vrednost ≤ 0,05 in absolutna vrednost spremembe izražanja ≥ 2. Posamezna obravnavanja so pokazala nad 100 diferencialno izraženih genov, ki sodelujejo v pomembnih bioloških procesih. Del genov je bilo skupno vsem obravnavanjem, kar kaže, da bi lahko različni viroidi in njihove kombinacije vplivali na nekaj skupnih genov (Jakše s sod. 2017; Mishra s sod., 2016).

2 CILJ: RAZVOJ NOVIH DIAGNOSTIČNIH ANALIZ

RAZVOJ RT-qPCR

V okviru razvoja novih diagnostičnih metod smo razvili RT-PCR v realnem času (RT-qPCR) za ločeno in hkratno določanje viroidov HLVd, HSVd in CBCVd v hmelju. Osnova metode, ki smo jo razvili, je uporaba specifičnih sond z vezanim reporterskim barvilom (HLVd:HEX, HSVd: Texas Red, CBCVd: Cy5) in dušilcem (BHQ1/BHQ2) (TaqMan). Za razvoj primerjev in sond smo uporabili referenčna zaporedja iz  NCBI GenBank. Poravnave med zaporedji viroidov smo naredili s programom ClustalW2, začetne oligonukleotide in sonde pa smo na podlagi teh poravnav nato načrtovali s pomočjo PrimeQuest in OligoAnalyzer 3.1. V okviru optimizacije koncentracij začetnih oligonukleotidov in sond smo kot optimalno koncentracijo za začetne oligonukleotide za CBCVd in HSVd določili 300 nM, za viroid HLVd pa 600 nM in za sonde za viroida HSVd in HLVd 100 nM oziroma 150 nM za CBCVd. V primeru hkratnega namnoževanja dveh ali več tarč, smo koncentracije začetnih oligonukleotidov zmanjšali na 300 nM, koncentracije sond pa na 100 nM.

 Vpliv RNA izolacije na RT-qPCR: Pri razvoju in optimizaciji RT-qPCR smo uporabili RNA izolacijo na osnovi komercialnega kompleta Spectrum® Plant Total RNA Isolation Kit (Sigma-Aldrich). Z namenom določitve vpliva metode izolacije RNA na detekcijo viroidov, smo razvito RT-qPCR metodo preizkusili še na celokupnih nukleinskih kislinah izoliranih s CTAB metodo. Analize niso zaznale bistvenega vpliva metode izolacije na detekcijo viroidov.

Validacija razvite metode: Analitsko občutljivost metode smo določili z uporabo umetno sintetiziranih zaporedij viroidov z znanimi koncentracijami (od 50 fg do 0,00005 fg). Na ta način smo lahko določili, da posamezen viroid lahko zaznamo do 0,005 fg. Občutljivost metode smo analizirali tudi na vzorcih okuženega hmelja in rezultate primerjali z metodo RT-PCR. Rezultati so pokazali od 100 do 100 krat večji stopnjo občutljivosti RT-qPCR v odvisnosti od posameznega viroida. Specifičnost metode RT-qPCR za posamezne viroide smo testirali na različne izolate CBCVd iz citrusov in za HSVd na izolate iz citrusov in vinske trte. Ponovljivost in reproduktibilnost metode smo testirali s petimi neodvisnimi testi, ki so bili izvedeni v različnih časovnih točkah in z različnimi operaterji.

3. CILJ: TESTIRANJE ODPORNOSTI GENOTIPOV HMELJA NA CBCVd

PREISKUŠANJE INOKULACIJSKIH TEHNIK

 Pred testiranjem odpornosti hmeljnih genotipov na CBCVd smo opravili optimizacijo inokulacijske metode s testiranjem 4 različnih inokulacijskih tehnik na indikatorskih rastlinah. Testirali smo infektivnost naslednjih inokulov: (1) surov rastlinski sok, (2) sok v fosfatnem pufru, (3) ekstrakt celokupnih nukleinskih kislin, pridobljen s CTAB metodo, (4) celokupni RNA ekstrakt. Vsak inokulum smo preizkusili v obsegu 10 rastlin/rastlinsko vrsto. Inokulirane rastline smo po okuževanju vzdrževali v rastni komori ter po 3 mesecih testirali z RT-PCR. Rezultati so pokazali najvišjo stopnjo infektivnosti RNA ekstrakta z 80-100% deležem  uspešnih okužb (Gucek s sod., 2015a; 2015b).

TESTIRANJE ODPORNOSTI SORT HMELJA

Testiranje odpornosti je zajelo 30 različnih genotipov in sort, ki predstavljajo glavne genetske vire hmelja. Rastline smo okuževali z RNA ekstraktom in sokom okuženih CBCVd donorskih rastlin v treh zaporednih inokulacijah. Časovni razmik med inokulacijami je bil 7-14 dni. Vse inokulirane rastline smo po preteku 3mesecev od zadnje inokulacije testirali z RT-qPCR z namenom potrditve okužbe. Ocenjevanja bolezenskih znamenj smo spremljali dve vegetaciji.   Rezultati testiranj so pokazali izrazite razlike med genotipi tako na nivoju dovzetnosti do okužb ter razvoja bolezenskih znamenj. Od 30 testirani genotipov smo odpornost oz toleranco zaznali pri sortah Galena, Nugget, Dana, Comet, Styrian Wolf, Styrian Cardinal in moškem genotipu 19058 (Radisek s sod., 2017a). Rezultati predstavljajo pomembno informacijo za pridelovalce glede izbire primernih sort na okuženih območjih in hkrati ključen vir za žlahtniteljske programe.

– 75%

Hmeljarska zadruga z.o.o. Žalec – 6%

Hmeljarstvo Čas: http://www.hmeljarstvo-cas.eu/ – 19%

V okviru projekta so nastale naslednje objave:

1. GUČEK T. s sod., 2015: Comparison of different methods for viroid plant inoculation. V: Viroid 2015 : book of abstracts, International Conference on Viroids and Viroid-like RNAs, České Budějovice, June 25-28, 2015. Düsseldorf: Düsseldorf University Press. 2015, str. 27-28. [COBISS.SI-ID 8301433]
2. GUČEK T. s sod., 2017: Razvoj metode umetnega okuževanja hmelja z monomerom in dimerom CBCVd . Hmeljarski bilten, ISSN 0350-0756. 2017, letn. 24, str. 5-16, ilustr. [COBISS.SI-ID8906361]
3. GUČEK T., s sod., 2016: Optimization of detection of hop latent viroid (HLVd) with real time RT-PCR. Hmeljarski bilten [COBISS.SI-ID8596089]
4. GUČEK T., s sod., 2017: Diagnostic techniques for viroids. Plant Pathology, ISSN 0032-0862, 2017, vol. 66, iss. 3, str. 339-358, [COBISS.SI-ID 8472953]
5. JAKŠE, J. s sod., 2017: In-depth sequencing of RNA to support new viroid discovery and to study viroid-hop (Humulus lupulus L.) interactions. V: Bioinformatics: from algorithms to applications : conference proceedings & conference schedule, August 1-5, 2017, Saint Petersburg, Russia. St. Petersburg: St. Petersburg University. 2017, str. 61. [COBISS.SI-ID 8773753]
6. MATOUŠEK J. s sod., 2017: Propagation and some physiological effects of Citrus bark cracking viroid and Apple fruit crinkle viroid in multiple infected hop (Humulus lupulus L.). Journal of Plant Physiology, ISSN 0176-1617, 2017, vol. 213, str. 166-177.[COBISS.SI-ID 8709241],
7. MISHRA A., s sod., 2016: Identification and characterization of microRNAs in Humulus lupulus using high-throughput sequencing and their response to Citrus bark cracking viroid (CBCVd) infection. BMC genomics, ISSN 1471-2164, 2016, no. 17:919, str. 1-19, doi: [COBISS.SI-ID 8522361]
8. RADIŠEK S. 2017: Hop viroids-research and activities in Slovenia : vabljeno predavanje na Institute of Environmental Biotechnology, Graz University of Technology, Graz, May 12th, 2017. [COBISS.SI-ID 895095]
9. RADIŠEK S. s sod., 2017: Management of citrus bark cracking viroid (CBCVd) on hop in Slovenia. V: WEIHRAUCH, Florian (ur.). Proceedings of the Scientific Commission [of the] International Hop Growers` Convention, St. Stefan am Walde, Austria, 25-29 June 2017, [COBISS.SI-ID 8748665]
10. RADIŠEK, Sebastjan, OREŠEK, Erika. PRA on Hop stunt viroid (HSVd) and Citrus bark cracking viroid (CBCVd) on hop : predavanje na Standing Committee on Plants, Animals, Food and Feed, Section Plant Health, 25. – 26. 1. 2016, Brussels. [COBISS.SI-ID 724108]
11. RADIŠEK, Sebastjan (avtor, fotograf, urednik), GUČEK, Tanja, LESKOŠEK, Gregor, BENKO-BELOGLAVEC, Anita, JAKŠE, Jernej, JAVORNIK, Branka. Huda viroidna zakrnelost hmelja. Žalec: Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, 2017. 29 str., Ilustr. ISBN 978-961-93322-1-4. [COBISS.SI-ID 288782592]

Priročnik Huda viroidna zakrnelost hmelja (2017) pdf [2,5 mB): (https://www.ihps.si/wp-content/uploads/2016/08/Huda-viroidna-zakrnelost-hmelja-2017.compressed.pdf).